反相色譜中,通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形,而帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾。究其原因,是硅膠表面殘留硅羥基對(duì)極性和堿性樣品分子產(chǎn)生的次級(jí)保留效應(yīng)(前提:排除色譜柱問(wèn)題和樣品過(guò)載問(wèn)題)。
峰形優(yōu)化實(shí)例分析
-分析物的部分結(jié)構(gòu)-
1、初始方法
以0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含0.5%三乙胺,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5)-甲醇(49∶51)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm;某未知品牌C18柱;初始結(jié)果:峰拖尾,峰寬5min,無(wú)法出尖峰。需要做方法優(yōu)化,達(dá)到峰形對(duì)稱(chēng)。
2、拖尾原因分析
反相填料表面有殘余的硅羥基,具有一定的酸性,其pKa約為4.5~4.7。根據(jù)電離規(guī)律,當(dāng)流動(dòng)相的pH-pKa>2即pH>6.7時(shí),99%以上的硅羥基應(yīng)是呈離子狀態(tài)的,即Si-O- 。
而當(dāng)pKa-pH>2即pH<2.5時(shí),酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離,99%以上的硅羥基應(yīng)是呈分子狀態(tài)的,即Si-OH,但其極性仍然存在,為Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-對(duì)于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力,這種作用力比范德華力要強(qiáng)得多。
同時(shí),因?yàn)楣枘z表面鍵合了C18長(zhǎng)鏈,由于空間位阻作用,樣品分子能接觸到殘余硅羥基的機(jī)會(huì)不多,只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強(qiáng)的靜電作用而被推遲洗脫出來(lái),峰形拖尾。
3、優(yōu)化方向
抑制硅膠上殘余硅羥基與分析物之間的作用,減弱次級(jí)吸附作用。
● 減少硅膠上殘余硅羥基或減少與分析物間發(fā)生作用的殘余硅羥基,占據(jù)硅羥基這個(gè)作用位點(diǎn)。比如,使用徹di封端的色譜柱;在流動(dòng)相中添加三乙胺(TEA)、四丁基硫酸氫銨等作為減尾劑,競(jìng)爭(zhēng)殘留硅羥基;調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH。
● 減少與殘余硅羥基發(fā)生作用的分析物離子,占據(jù)-NH2、-NHR、-NR2這些分析物作用位點(diǎn)。比如,加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對(duì)試劑。
● 干擾殘余硅羥基與分析物間的相互作用。比如加入緩沖鹽,增強(qiáng)流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。
4、優(yōu)化過(guò)程
#01、選擇合適的高純硅膠徹di封端色譜柱:Blossmate® Polar RP(4.6*300mm,5μm)。
分析:峰拖尾,峰寬2min,優(yōu)于初始條件的結(jié)果。拖尾的嚴(yán)重程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同。從填料合成的角度而言就是:鍵合密度是否高、封尾是否徹di。高密鍵合和徹di的封尾能顯著減少靜電作用機(jī)會(huì),獲得良好的峰形。月旭科技Ultimate®系列XB-C18、AQ-C18、Blossmate®系列Polar RP和Xtimate®系列C18采取的就是高密鍵合和徹di的雙峰尾工藝。
#02、降低流動(dòng)相pH:改為2.5,后續(xù)一直使用Blossmate® Polar RP色譜柱。
分析:酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離,拖尾稍有改善,但不明顯,pH對(duì)峰形改善作用較小。
#03、水相添加磷酸二氫鉀,減小庚烷磺酸鈉濃度,流動(dòng)相改為:0.01mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-甲醇(49∶51)
分析:流動(dòng)相中緩沖鹽爆發(fā)出力挽狂瀾的氣勢(shì),峰拖尾現(xiàn)象變成峰前延。
#04、恢復(fù)庚烷磺酸鈉濃度,流動(dòng)相改為:0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-甲醇(49∶51)。
分析:峰拖尾,比不加磷酸鹽時(shí)峰形好。根據(jù)3和4的結(jié)果可以推斷:在0.01mol/L 至0.02mol/L之間范圍濃度的庚烷磺酸鈉溶液(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-甲醇(49∶51)可以使得峰形對(duì)稱(chēng)。
#05、流動(dòng)相改為:0.015mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺, pH 2.8)-甲醇(49∶51)。
分析:拖尾改善,峰形較好??梢钥闯?,調(diào)整庚烷磺酸鈉濃度對(duì)峰形的改善作用較大。
#06、流動(dòng)相改為:0.015mol/L庚烷磺酸鈉溶液(0.5%三乙胺, pH2.9)-甲醇(49∶51)。
分析:峰拖尾??梢园l(fā)現(xiàn),在沒(méi)有磷酸二氫鉀存在的情況下,同時(shí)改變庚烷磺酸鈉和pH,與1的結(jié)果比較,峰形雖有改善,不對(duì)稱(chēng)由3.38變?yōu)?.13,作用不大。流動(dòng)相中磷酸二氫鉀的存在具有決定性作用。
#07、主要通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相中庚烷磺酸鈉濃度來(lái)改善峰形,流動(dòng)相改為:0.0125mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺, pH 3.1)-甲醇(49∶51)。
分析:峰前延。
#08、增加庚烷磺酸鈉濃度,流動(dòng)相改為:0.0138mol/L庚烷磺酸鈉溶液(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺, pH3.14)-甲醇(49∶51)。
分析:峰拖尾因子1.24。后續(xù)只需微調(diào)庚烷磺酸鈉濃度于0.0125-0.0138mol/L(含50mmol/L磷酸二氫鉀,0.5%三乙胺,微調(diào)pH約至2.5),可進(jìn)一步優(yōu)化峰形。
#01、相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同,高密鍵合和徹di的封尾能顯著減少靜電作用機(jī)會(huì),獲得良好的峰形。
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#02、流動(dòng)相中加入磺酸鹽離子對(duì)試劑能與樣品分子作用,從而阻止樣品分子與殘留硅羥基發(fā)生次級(jí)吸附作用,進(jìn)而改善峰形及增加保留。一般加入0.003-0.01mol/L濃度。
#03、流動(dòng)相中加入緩沖鹽,增強(qiáng)了流動(dòng)相的離子強(qiáng)度,在-NH3+等極性基團(tuán)和硅羥基Si-O-之間存在著許多離子的干擾,減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機(jī)會(huì),有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的相互作用,改善峰形。
#04、加入三乙胺作為減尾劑改善峰形的時(shí)候,有兩點(diǎn)需要注意:
● 三乙胺的堿性很強(qiáng),加入三乙胺后流動(dòng)相的pH可能超出色譜柱的使用范圍,對(duì)色譜柱造成損傷。pH的改變也會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間的顯著變化,可能引起的其它問(wèn)題,建議流動(dòng)相中加入三乙胺后回調(diào)至未加入前的pH值。通常即使pH回調(diào)過(guò)后,由于三乙胺成為了固定相的一部分,保留時(shí)間也有較大變化;
● 三乙胺在210nm處有一定的吸收,如果液相方法中檢測(cè)波長(zhǎng)在210nm以下測(cè)定時(shí)需要謹(jǐn)慎使用。四烷基季銨鹽(如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等)在水中電離后,也形成了類(lèi)似N+H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N+(CH2CH2CH2CH3)4,這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si-O-產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用,阻止氨基與硅羥基的接觸,改善峰形。而且它還有一個(gè)不同于三乙胺的顯著特點(diǎn)是,在低波長(zhǎng)范圍其紫外吸收比三乙胺弱,檢測(cè)波長(zhǎng)在210nm以下測(cè)定時(shí)可選擇使用。
● 酸性化合物拖尾需要降低流動(dòng)相的pH值,盡量使酸質(zhì)子化;可以通過(guò)向流動(dòng)相中加入競(jìng)爭(zhēng)的有機(jī)酸得到較好結(jié)果,如使用0.1%三氟yi酸 (TFA) ,并且這種添加劑具有比較低的紫外截止波長(zhǎng)。
參考資料:食品伙伴網(wǎng)